【Pulldown工作原理】

DNA/RNA Pulldown(Pull-down)是一種用于研究核酸與蛋白質(zhì)相互作用的體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)，是研究基因調(diào)控機(jī)制的重要工具。其工作原理為；鏈親和素磁珠能夠與生物素標(biāo)記的核酸/蛋白復(fù)合物結(jié)合。 在磁場(chǎng)下或通過(guò)離心使結(jié)合物與上清液分離，吸棄上清液并洗滌磁珠，然后用解離液使蛋白質(zhì)變性而與磁珠解離。解離液中的蛋白質(zhì)可直接通過(guò)質(zhì)譜或通過(guò)Western Blotting（WB）進(jìn)行鑒定。解離液也 可以用SDS PAGE 或雙向電泳分離，并用高敏考馬斯亮藍(lán)（CBB）染色，從染色膠上切下的蛋白帶進(jìn)行質(zhì)譜分析（見(jiàn)圖1與2）。

【Pulldown實(shí)驗(yàn)步驟】

  Pulldownd基本步驟如下：

1. 設(shè)計(jì)及標(biāo)記探針：針對(duì)目標(biāo)基因的調(diào)控區(qū)域設(shè)計(jì)特異性DNA探針，通常使用脫硫生物素進(jìn)行標(biāo)記。
2. 制備樣品：依不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑯悠房梢允羌?xì)胞核蛋白、胞漿蛋白、全細(xì)胞或菌液、或純化蛋白。
3. 孵育：將制備的樣品液與標(biāo)記探針共同孵育，使DNA結(jié)合蛋白與靶向序列結(jié)合，然后與親和素磁珠孵育，使形成蛋白-核酸-生物素-親和素磁珠復(fù)合物。
4. 純化和洗滌：通過(guò)親和素磁珠純化蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，洗滌去除未結(jié)合及非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
5. 結(jié)合與分離：通過(guò)解離液將結(jié)合蛋白從復(fù)合物解離出來(lái)。
6. 蛋白質(zhì)檢測(cè)：使用WB 或質(zhì)譜鑒定與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)類型。

【Pulldown種類】

依據(jù)標(biāo)記探針的結(jié)合對(duì)象，Pulldown分為直接法與間接法（見(jiàn)相關(guān)介紹）：如果標(biāo)記DNA/RNA探針直接與蛋白結(jié)合，對(duì)下拉的蛋白進(jìn)行分析鑒定的實(shí)驗(yàn)稱為直接Pulldown。標(biāo)記探針不與蛋白結(jié)合，通過(guò)與目標(biāo)DNA/RNA雜交，分析鑒定下拉目標(biāo)DNA/RNA的結(jié)合蛋白的方法稱為間接Pulldown。

依據(jù)所用探針以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯糜诜治鯠NA還是RNA結(jié)合蛋白，Pulldown可分為DNA Pulldown 與 RNA Pulldown兩大類。

直接法Pulldown有兩種：1）用已知結(jié)合序列的DNA/RNA探針探查相應(yīng)結(jié)合蛋白，檢測(cè)意義與EMSA相似，可準(zhǔn)確確定核酸/蛋白復(fù)合物的組分以及結(jié)合蛋白家族成員的亞單位。2）用未知或不確定結(jié)合序列的DNA/RNA片段探查結(jié)合蛋白。用這種Pulldown需要有純化的DNA/RNA片段并對(duì)片段進(jìn)行標(biāo)記，需要確定結(jié)合蛋白數(shù)量與種類，以及蛋白與DNA/RNA的結(jié)合序列，變量較多，后期分析工作量大。

間接法Pulldown也分為DNA或RNA Pulldown兩類，可用于；1）探測(cè)與長(zhǎng)鏈DNA/RNA分子結(jié)合的已知或未知蛋白，2）確定與長(zhǎng)鏈DNA/RNA分子結(jié)合的多種蛋白成分，3）用于分析與各種非編碼RNA（circRNA、lncRNA、eRNA等）或DNA結(jié)合的蛋白。

微奧基因提供各種Pulldown實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品與技術(shù)服務(wù)。