Pulldown


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    Pulldown工作原理Pulldown_pricpl

    DNA/RNA Pulldown(Pull-down)是一種用于研究核酸與蛋白質(zhì)相互作用的體外實(shí)驗(yàn)技術(shù),是研究基因調(diào)控機(jī)制的重要工具。其工作原理為;鏈親和素磁珠能夠與生物素標(biāo)記的核酸/蛋白復(fù)合物結(jié)合。 在磁場(chǎng)下或通過(guò)離心使結(jié)合物與上清液分離,吸棄上清液并洗滌磁珠,然后用解離液使蛋白質(zhì)變性而與磁珠解離。解離液中的蛋白質(zhì)可直接通過(guò)質(zhì)譜或通過(guò)Western Blotting(WB)進(jìn)行鑒定。解離液也 可以用SDS PAGE 或雙向電泳分離,并用高敏考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色,從染色膠上切下的蛋白帶進(jìn)行質(zhì)譜分析(見(jiàn)圖1與2)。

    Pulldown實(shí)驗(yàn)步驟

      Pulldownd基本步驟如下:

  1. 設(shè)計(jì)及標(biāo)記探針:針對(duì)目標(biāo)基因的調(diào)控區(qū)域設(shè)計(jì)特異性DNA探針,通常使用脫硫生物素進(jìn)行標(biāo)記。
  2. 制備樣品:依不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑯悠房梢允羌?xì)胞核蛋白、胞漿蛋白、全細(xì)胞或菌液、或純化蛋白。
  3. 孵育:將制備的樣品液與標(biāo)記探針共同孵育,使DNA結(jié)合蛋白與靶向序列結(jié)合,然后與親和素磁珠孵育,使形成蛋白-核酸-生物素-親和素磁珠復(fù)合物。
  4. 純化和洗滌:通過(guò)親和素磁珠純化蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,洗滌去除未結(jié)合及非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
  5. 結(jié)合與分離:通過(guò)解離液將結(jié)合蛋白從復(fù)合物解離出來(lái)。pulldown_SDSgel
  6. 蛋白質(zhì)檢測(cè):使用WB 或質(zhì)譜鑒定與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)類型。

Pulldown種類

依據(jù)標(biāo)記探針的結(jié)合對(duì)象,Pulldown分為直接法與間接法(見(jiàn)相關(guān)介紹):如果標(biāo)記DNA/RNA探針直接與蛋白結(jié)合,對(duì)下拉的蛋白進(jìn)行分析鑒定的實(shí)驗(yàn)稱為直接Pulldown。標(biāo)記探針不與蛋白結(jié)合,通過(guò)與目標(biāo)DNA/RNA雜交,分析鑒定下拉目標(biāo)DNA/RNA的結(jié)合蛋白的方法稱為間接Pulldown

依據(jù)所用探針以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯糜诜治鯠NA還是RNA結(jié)合蛋白,Pulldown可分為DNA Pulldown 與 RNA Pulldown兩大類。

直接法Pulldown有兩種:1)用已知結(jié)合序列的DNA/RNA探針探查相應(yīng)結(jié)合蛋白,檢測(cè)意義與EMSA相似,可準(zhǔn)確確定核酸/蛋白復(fù)合物的組分以及結(jié)合蛋白家族成員的亞單位。2)用未知或不確定結(jié)合序列的DNA/RNA片段探查結(jié)合蛋白。用這種Pulldown需要有純化的DNA/RNA片段并對(duì)片段進(jìn)行標(biāo)記,需要確定結(jié)合蛋白數(shù)量與種類,以及蛋白與DNA/RNA的結(jié)合序列,變量較多,后期分析工作量大。

間接法Pulldown也分為DNA或RNA Pulldown兩類,可用于;1)探測(cè)與長(zhǎng)鏈DNA/RNA分子結(jié)合的已知或未知蛋白,2)確定與長(zhǎng)鏈DNA/RNA分子結(jié)合的多種蛋白成分,3)用于分析與各種非編碼RNA(circRNA、lncRNA、eRNA等)或DNA結(jié)合的蛋白。

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