微奧基因的生物素標(biāo)記探針的EMSA測定(濕轉(zhuǎn)膜,查看)可在8小時左右出結(jié)果。以后再經(jīng)過我們科學(xué)家改進,生物素標(biāo)記探針的EMSA(半干轉(zhuǎn)膜,查看)可在4個時左右完成。我公司最新成果使EMSA測定能在2小時左右完成,不僅快,關(guān)鍵是操作非常簡單(查看比較幾種不同EMSA方法),使之成為遠比Western Blot測定磷酸化信號分子或免疫熒光更為簡便有效的測定TF的技術(shù)。
A. 2小時EMSA的工作原理:
快遞EMSA是通過近紅熒為分子標(biāo)記探針完成的,工作原理非常簡單:熒光標(biāo)記探針與轉(zhuǎn)錄因子相比分子量相對很小,在電泳中移動快。而熒光探針與轉(zhuǎn)錄團子結(jié)合的復(fù)合物分子量增加10倍以上,電泳移動慢。近紅熒光探針在凝膠板中的位置可通過掃描儀確定。
B. 2小時EMSA的優(yōu)點:
1) 非放射性。
2) 試劑在適當(dāng)溫度可保持一年以上,隨時取用。
3) 操作十分簡單,整個操作只相當(dāng)于跑一次垂直板凝膠電泳。
4) 大概2小時出結(jié)果。
5) 適合定量分析。
6) RNA EMSA測定的首選方法。
由于以上顯著優(yōu)點,是否EMSA測定方法(同位素法,生物素法以及地高辛法)就應(yīng)該淘汰呢?答案是否定的,主要有以下限制與問題存在:
C. 2小時EMSA的問題:
1)設(shè)備問題。采用熒光標(biāo)記探針的非放射性EMSA一直有人試,但無法解決靈敏度低的問題。Licor公司開發(fā)的近紅外熒光技術(shù)與相應(yīng)儀器輝快了長期困擾的靈敏度問題。但Licor公司的近紅外掃描儀(Odyssey)需要20多萬一臺。如果沒有Odyssey,用戶愿意為了做EMSA購買一臺嗎?一般來講,近紅外標(biāo)記探針的EMSA比較適合已經(jīng)有Odyssey近紅外掃描儀的大學(xué)與科研院所。
2)探針問題。在已經(jīng)有Odyssey近紅外掃描儀的單位進行近紅熒光標(biāo)記的EMSA還是有相當(dāng)困難。一是在國內(nèi)沒有任何一家應(yīng)用LiCor公司的lRDye700/800進行核酸探針的公司。即使使用替代近紅外熒光(如CY5.5等)來標(biāo)記探針,國內(nèi)外的價格較生物素標(biāo)記貴近4-5倍。例如,5 OD的探針,DNA合成公司對生物素標(biāo)記的收費為300-500元/鏈,地高辛標(biāo)記400-600元/鏈。而用CY5.5標(biāo)記DNA鏈的價格為1500-2000元/鏈(生工網(wǎng)上顯示收費1500元,寶生物為2200元)。因為EMSA探針為雙鏈,實際合成探針的費用還要X2,再加上合成Olig的費用。僅僅合成帶近紅熒光寡核苷酸的費用就在4000元左右,還不包括后面雙鏈制作,純化以及比活性測定。這樣的費用使一些用戶望而卻步,寧可采用相對較便宜的生物素(化學(xué)發(fā)光)標(biāo)記探針的EMSA。
3)由于近紅外熒光標(biāo)記物的松散的化學(xué)結(jié)構(gòu)(比較結(jié)構(gòu)的差別)。標(biāo)記的探針很容易產(chǎn)生聚積而不進膠,使結(jié)合信號變?nèi)酢T趪猓胁簧儆脩糇约汉铣山t外熒光探針但都因為探針聚積問題而放棄了。Li-Cor公司的解決方法是改用4-20%的梯度膠。即使這樣,NFKB的EMSA結(jié)果仍顯示在上樣孔有明顯的探針聚積(查看Li-Cor用4-12%凝膠電泳的NFkB圖譜)。
D. Vingene所解決的技術(shù)難題:
1)發(fā)展了近紅外熒光探針標(biāo)記的新技術(shù),使近紅外探針的價格大幅降低,到達與其它非放射性探針相近的價位。
2)比較好的解決了探針聚積問題,使結(jié)果更清晰、漂亮。
E. 2小時EMSA所需要的條件:
1)近紅外熒光標(biāo)記探針(微奧基因的成套試劑已包括,或選用微奧基因的探針定制服務(wù))。
2)近紅外熒光探針與樣品反應(yīng)結(jié)合液(微奧基因的成套試劑已包括)。
3)樣品上樣液(微奧基因的成套試劑已包括)。
4)用于EMSA的預(yù)制凝膠板(微奧基因產(chǎn)品,選購項)。
5)Li Cor的近紅外熒光掃描儀或任何能夠?qū)?00nm熒光進行掃描儀器(客戶自備)。