A. miRNA電泳檢測(miREFA),miRNA橫流層析檢測見相關(guān)網(wǎng)頁。
MicroRNA(miRNA)為長度為18-23個(gè)堿基的單鏈核苷酸,參與細(xì)胞增殖、分化和死亡等生物過程,與許多疾病相關(guān)并可能成為疾病的生物標(biāo)志物,為現(xiàn)代生物學(xué)與生物醫(yī)學(xué)熱門研究領(lǐng)域[9-10]。
人類miRNA已發(fā)現(xiàn)有近5千種,以其中的miRNA21為例,在Google學(xué)術(shù)限定搜索“miR 21”,結(jié)果顯示有428000篇文獻(xiàn)報(bào)道(Fig.1)。相信以“miR21"“miRNA 21”或“miRNA21"名字發(fā)表的文章應(yīng)該不少,可見miRNA的研究之熱度。
現(xiàn)已開發(fā)了多種檢測 miRNA 的技術(shù),包括用放射性標(biāo)記的探針進(jìn)行 RNA 印跡分析[11],基于微陣列[12]和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法[13],液相單細(xì)胞測定[14],原位雜交[15-16]和高通量測序[17]等。然而,這些方法都有其固有的局限性,但是檢測 miRNA 依然面臨著重大挑戰(zhàn)。
Northern印跡法曾經(jīng)是檢測miRNA的,廣泛使用標(biāo)準(zhǔn)方法,可以檢測miRNA的相對(duì)分子大小和豐度,但其也存在低通量、耗時(shí)長、易降解等缺點(diǎn),并且敏感度較低,無法檢測到分子量較低的miRNA。
實(shí)時(shí)定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT- PCR)具有動(dòng)態(tài)范圍大、靈敏度高、序列特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),已成為檢測miRNA表達(dá)的常規(guī)和可靠技術(shù)。 但qRT-PCR測定的miRNA并非樣品的實(shí)際表達(dá)量,難于區(qū)分miRNA之間的單核苷酸差異,并且還有假陽性以及引物設(shè)計(jì)困難的問題。
微陣列技術(shù)是一種快速、高通量檢測miRNAs的方法,但成本高,不能檢測分子量較低的miRNA,對(duì)序列相似的miRNA的分辨性不好,也有假陽性問題。
一些學(xué)者開發(fā)了各種等溫分析技術(shù),包括滾環(huán)擴(kuò)
增(RCA),指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(EXPAR),環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP),雜交鏈反應(yīng)和催化發(fā)夾組裝。盡管這些測定具有簡單甚至無需儀器操作的優(yōu)點(diǎn),但也存在限制其廣泛應(yīng)用的缺點(diǎn),例如EXPAR和LAMP的非特異性擴(kuò)增和高背景信號(hào),以及雜交鏈反應(yīng)和催化發(fā)夾組裝的相對(duì)較慢的動(dòng)力學(xué)和低靈敏度。
B. miREFA的技術(shù)優(yōu)勢
微奧基因(viagene)公司開發(fā)的快速microRNA Electrophoretic Fluorescence Assay (miREFA) 是檢測miRNA的有力工具,其工作原理是基于分子雜交,未雜交的探針比與RNA/DNA與探針的雜交體的分子量小,導(dǎo)致在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠中移動(dòng)速度變化,游離探針與雜交體位置不同,探針在電泳膠中的位置通過熒光標(biāo)記物在熒光掃描儀或成像儀顯現(xiàn)。 MiREFA具有以下優(yōu)勢與特點(diǎn)。
1)快速出結(jié)果:miREFA技術(shù)能夠使分子雜交在短時(shí)間內(nèi)完成,全部測定包括電泳可以在2小時(shí)內(nèi)完成(Fig.2,時(shí)間安排)。
2)靈敏度高:miREFA kits使用近紅外標(biāo)記探針,并采用特殊方法大大提高檢測靈敏度,能夠測定飛克摩水平的miRNA(Fig.3
3)操作簡便:miREFA在現(xiàn)有miRNA檢測方法中為最簡便的操作技術(shù),簡單操作與快速出結(jié)果能大大降低樣品降解(見操作說明書)。
4)分辨率高:miREFA技術(shù)能夠分辨同種miRNA間的單個(gè)堿基長短變化(圖4),能鑒別區(qū)分單個(gè)堿基突變,也能區(qū)分miRNA前體與成熟miRNA。
5)樣品絕對(duì)量檢測:miREFA所測定的是單位樣品體積中的miRNA絕對(duì)量,不涉及任何擴(kuò)增、放大。
6)定量檢測:miREFA能夠?qū)λ鶞y定的miRNA進(jìn)行定量分析。
C. miREFA所需要的試劑與條件:
1)熒光標(biāo)記探針:微奧基因的即用kit已包括探針,客戶也可向我們定制個(gè)性化探針。
2)需要能使探針與目標(biāo)分子快速雜交的試劑以及用于檢測miRNA的電泳系統(tǒng),微奧基因的即用kti已包括所有試劑。
3)需要米R(shí)EFA專用垂直電泳預(yù)制膠(微奧基因產(chǎn)品,選購項(xiàng))或按照說明用Kit所帶試劑配置專用變性膠。
5)客戶需要自備能夠?qū)R700熒光進(jìn)行圖像掃描的儀器(如Li Cor公司的Odyssey 近紅外熒光掃描儀)或任何能夠檢測700nm熒光的成像儀(客戶自備)。
微奧基因提供的快速miRNA檢測技術(shù)涉及多項(xiàng)美國專利與技術(shù)秘密。由于時(shí)間有限,現(xiàn)僅提供有限類別的miRNA測定Kits,如Let-7、miRNA21、MiRNA122、MiRNA144,MiRNA145、MiRNA155的檢測。
為使客戶能夠開展其它類別的mRNA檢測,現(xiàn)開展為期兩個(gè)月的優(yōu)惠活動(dòng);凡是訂購我司尚未開發(fā)的miRNA檢測,客戶在購買miREFA通用試劑基礎(chǔ)上,個(gè)性化訂購檢測miRNA的探針享受50%優(yōu)惠(miRNA檢測探針涉及多個(gè)熒光分子標(biāo)記,正常價(jià)格2100元)。
微奧基因的miRNA測定Kits按標(biāo)簽顯示溫度存放,可以保存一年。