RNA與生命息息相關:mRNA是直接指導蛋白質生物合成的模板,參與基因表達中的信息傳遞過程。近來的研究發現即使不參與蛋白編碼的RNA(ncRNA)也在積極發揮基因調節作用。ncRNA包括許多類型;包括小分子的miRNA與piRNA(Piwi相互作用RNA)與長分子的非編碼RNA(lncRNA)與環形RNA(circRNA)。
從檢測技術上講,檢測長鏈RNA與小分子RNA沒有本質不同,都是基于靶分子與探針的雜交。但檢測小分子RNA的試劑有其獨特性,我們另做專章介紹。此處涉及到的RNA檢測適用于長度大于100nt的RNA,如mRNA、lncRNA或circRNA等的檢測。
現已有多種檢測長鏈RNA的技術,包括用放射性標記的探針進行 RNA 印跡分析(Northern blotting),基于微陣列[12]和基于聚合酶鏈式反應(PCR)的方法[13],液相單細胞測定[14],原位雜交[15-16]和高通量測序[17]等。然而,這些方法都有其固有的局限性。
Northern印跡法曾經是檢測RNA的標準方法,可以檢測RNA的相對分子大小和豐度,但存在低通量、耗時長、易降解,敏感度較低等缺點,現在已較少應用。
實時定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)具有動態范圍大、靈敏度高、序列特異性強等優點,已成為檢測miRNA表達的常規和可靠技術。 但qRT-PCR測定的RNA并非樣品的實際表達量,難于區分RNA的單核苷酸突變,并且還有假陽性等問題。
微陣列技術是一種快速、高通量檢測RNAs的方法,但成本高、靈敏度低、對序列相似的RNA分辨差,也有假陽性問題。
一些學者開發了各種等溫分析技術,包括滾環擴增(RCA),指數擴增反應(EXPAR),環介導的等溫擴增(LAMP),雜交鏈反應和催化發夾組裝。盡管這些測定具有簡單甚至無需儀器操作的優點,但也存在限制其廣泛應用的缺點,例如EXPAR和LAMP的非特異性擴增和高背景信號,以及雜交鏈反應和催化發夾組裝的相對較慢的動力學和低靈敏低。
微奧基因(viagene)公司開發的快速 RNA Electrophoretic Fluorescence Assay (REFA) 技術提供了檢測RNA的另一種有力工具,有以下優勢與特點。
1)靈敏度高:REFA使用高靈敏度的紅外標記探針,并采用特技術提高檢測靈敏度,使其能測定飛克摩水平的RNA(圖1)。
2) 快速出結果:微奧基因的獨特技術能夠使分子雜交在幾分鐘內完成(Northern印跡需要雜交過夜),REFA測定能在2小時內完成(圖2,時間安排)。
3) 操作簡便:REFA在現有RNA檢測方法中為最簡便的操作技術。
4)操作簡單與快速出結果(見操作說明書)能大大降低RNA降解。
5)分辨率高:REFA技術能夠提供靶分子大小信息,能夠區分RNA的單堿基突變(圖5)。
6)絕對量檢測:REFA測定的是單位樣品體積中的RNA絕對量,不涉及任何擴增放大。
7)定量檢測:REFA能夠對所測定的RNA進行定量分析。
REFA所需要的試劑與條件:
1)能與靶分子配對雜交的熒光標記探針,客戶可與我們聯系,定制個性化探針。
2)需要能使探針與目標分子快速雜交的試劑以及用于檢測miRNA的電泳系統,微奧基因的即用kit已包括所有試劑。
3)需要自備小型垂直電泳系統,并按照使用說明配制REFA專用電泳凝膠。REFA專用專用預制膠或按照說明用Kit所帶試劑配置專用變性膠。
4)客戶需要自備能夠對IR700熒光進行圖像掃描的儀器,如Li Cor公司的Odyssey 掃描儀或任何能夠檢測700nm熒光的成像儀。
微奧基因的REFA Kits按標簽顯示的溫度存放,可以保存一年。