T許多年來，一直都不是很清楚非編碼的長RNA（LncRNA）有什么作用,近幾年的研究發現LncRNA（mRNA)在基因調控方面發揮了重要作用。 mRNA疫苗在抗新冠疫情中取得的成功是mRNA作為新型治療藥物的概念興起，由 mRNA 編碼出的抗原決定簇不僅數量眾多且類型豐富 [1-3]。與 DNA 藥物相比，mRNA 藥物不會插入基因組之中 [2-8]，可通過正常代謝途徑分解，安全性更高 [5-6]；mRNA 藥物無需進入細胞核便可發揮其功能，既可以通過體外轉錄，也能夠在患者體內合成所需的治療性蛋白質，設計和起效更加靈活快速。為個性化治療開辟了新的道路；mRNA 疫苗編碼的蛋白可通過激活免疫細胞觸發機體免疫反應，可用于癌癥免疫治療、傳染病疫苗或蛋白質替代等生物醫學和臨床醫學領域 [7]。目前，針對晚期黑色素瘤的 mRNA 疫苗Ⅰ期臨床試驗已經完成 [8]。此外，新冠肺炎 mRNA 疫苗的開發與研究也成為近期研究的熱點 [2]。除了作為疫苗抗原的表達模板外，mRNA 藥物還具有多種功能。首先，mRNA 可以作為癌癥治療的生物標志物 [9]。mRNA 直接或間接地影響體內細胞變化，發生相應的基因表達，反映組織的病理狀態。因此通過檢測細胞內 mRNA 的變化，可以為早期疾病的檢測提供線索和生理依據。其次，mRNA 動態檢測可作為組織檢測的有效補充，且在無癥狀人群中的檢測效率較高，可以對多種疾病進行診斷和評估，有潛力替代直接的組織取樣檢測 [9-10]。在上述 mRNA 藥 物 研 究 過 程 中， 對 體 內 外 mRNA 水平的準確檢測能反映基因的表達情況，時刻監測 mRNA 藥物的療效和毒性。因此快速、靈敏、特異性強的 mRNA 檢測方法非常重要。常見的 mRNA 檢測方法有：逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、恒溫擴增技術、細胞成像技術等（見圖 1）。在對mRNA的機理研究或將mRNA作為疾病的生物標志物，準確測定mRNA表達水平非常重要。mRNA的檢測技術已發展成為了獨立的研究領域，現已開發了多種檢測 mRNA 的技術，包括用放射性標記的探針進行 RNA 印跡分析[11]，基于微陣列[12]和基于聚合酶鏈式反應(PCR)的方法[13]，液相單細胞測定[14]，原位雜交[15-16]和高通量測序[17]等。然而，這些方法都有其固有的局限性，但是檢測 mRNA 依然面臨著重大挑戰。對 體 內 外 mRNA 水平的準確檢測能反映基因的表達情況，時刻監測 mRNA 藥物的療效和毒性。因此快速、靈敏、特異性強的 mRNA 檢測方法非常重要。常見的 mRNA 檢測方法有：逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、恒溫擴增技術、細胞成像技術等（見圖 1）。。理想的 mRNA 測定應滿足幾個要求: 1）靈敏度足夠高，能夠檢測容量很少的樣品。2）能夠對mRNA 含量進行定量分析。3）特異性強，能夠檢測 mRNA之間的單核苷酸差異。4）操作簡易而不需要昂貴的試劑或設備[18]。5）能夠快速出結果。 Northern印跡法曾經是檢測mRNA的廣泛使用標準，可以檢測mRNA的相對分子大小和豐度，但其也存在低通量、耗時長、易降解等缺點，并且敏感度較低，無法檢測到分子量較低的mRNA。實時定量PCR(quantitativereal-timePCR，qRT- PCR)具有動態范圍大、靈敏度高、序列特異性強等優點，已成為檢測mRNA表達的常規和可靠技術。 但qRT-PCR測定的mRNA并非樣品的實際表達量，難于區分mRNA之間的單核苷酸差異，并且還有假陽性以及引物設計困難的問題。微陣列技術是一種快速、高通量檢測mRNAs的方法，但成本高，不能檢測分子量較低的mRNA，對序列相似的mRNA的分辨性不好，也有假陽性問題。為了推進mRNA檢測，一些學者開發了各種等溫分析技術，包括滾環擴增（RCA），指數擴增反應（EXPAR），環介導的等溫擴增（LAMP），雜交鏈反應和催化發夾組裝。盡管這些測定具有簡單甚至無需儀器操作的優點，但也存在限制其廣泛應用的缺點，例如EXPAR和LAMP的非特異性擴增和高背景信號，以及雜交鏈反應和催化發夾組裝的相對較慢的動力學和低靈敏度。微奧基因 生物技術公司開發的快速messageRNA Electrophoretic Fluorescence Assay (msREFA) 技術是檢測mRNA的有力工具。其工作原理是基于分子雜交，未雜交的探針比與RNA/DNA與探針的雜交體的分子量小，導致在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠中移動速度變化，游離探針與雜交體位置不同，探針在電泳膠中的位置通過熒光標記物在熒光掃描儀或成像儀顯現。msREFA具有以下優勢與特點。 1.靈敏度高：msREFA kits使用近紅外標記探針，并采用特殊方法大大提高檢測靈敏度，能夠測定飛克摩水平的mRNA（圖1，檢測靈敏度）。 2.快速出結果：msREFA技術能夠使分子雜交在20分鐘內完成，mRNA測定在2小時內完成（圖2，時間安排）。 3.操作簡便：msREFA在現有mRNA檢測方法中為最簡便的操作技術，簡單操作與快速出結果能大大降低樣品降解（見操作說明書）。 4.分辨率高：msREFA技術能夠區分mRNA前體與成熟mRNA（圖3。區分mRNA的分子大小（圖4），以及同種mRNA間的單個堿基變異（圖5）。 5.絕對量檢測：msREFA不涉及任何擴增，所測定的是單位樣品體積中的mRNA絕對量。 6.定量檢測：msREFA能夠對所測定的mRNA進行定量分析。在新冠病毒的檢測中，原位雜交技術也提供了一種快速檢測的思路。Wang 等 [36] 基于雜交捕獲熒光免疫測定（hybrid capture fluorescence immunoassay，HC-FIA）技術，將雜交和免疫熒光分析結合，開發出了一種新型無需擴增的 SARS-CoV-2 核酸檢測平臺，能夠在 1 h 內完成對 SARS-CoV-2 的檢測。首先，在反應管中，優化的 DNA 探針與 SARS-CoV-2 病毒基因組保守的開放閱讀框 1ab（ORF1ab）、包膜蛋白（E）和核衣殼（N）區域結合，形成 DNA-RNA 復合物，進而被熒光納米顆粒標記的 S9.6 抗體捕獲；然后，在免疫熒光分析階段，將 S9.6 抗體以及抗兔IgG 抗體分別噴涂在試紙條的測試線（T）和對照線（C）上，將反應液滴在樣品墊上，在毛細管張力的作用下，復合物到達 T 區，被 S9.6 抗體捕獲，逐漸產生熒光信號。在 C 區，熒光納米粒子（fluorescent nanoparticles，FNP）標記的兔 IgG 被抗兔 IgG 捕獲，也產生熒光；最后，使用熒光閱讀器讀取 T/C 熒光值來進行定量分析。相比當前常用的 qPCR 技術，這種新型技術的檢測限能達到每毫升 500 拷貝，且已被開發成用于診斷 SARS-CoV-2 的檢測試劑盒。