mRNA/lncRNA問題


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  T許多年來,一直都不是很清楚非編碼的長RNA(LncRNA)有什么作用,近幾年的研究發現LncRNA(mRNA)在基因調控方面發揮了重要作用。 mRNA疫苗在抗新冠疫情中取得的成功是mRNA作為新型治療藥物的概念興起,由 mRNA 編碼出的抗原決定簇不僅數量眾多且類型豐富 [1-3]。與 DNA 藥物相比,mRNA 藥物不會插入基因組之中 [2-8],可通過正常代謝途徑分解,安全性更高 [5-6];mRNA 藥物無需進入細胞核便可發揮其功能,既可以通過體外轉錄,也能夠在患者體內合成所需的治療性蛋白質,設計和起效更加靈活快速。為個性化治療開辟了新的道路;mRNA 疫苗編碼的蛋白可通過激活免疫細胞觸發機體免疫反應,可用于癌癥免疫治療、傳染病疫苗或蛋白質替代等生物醫學和臨床醫學領域 [7]。目前,針對晚期黑色素瘤的 mRNA 疫苗Ⅰ期臨床試驗已經完成 [8]。此外,新冠肺炎 mRNA 疫苗的開發與研究也成為近期研究的熱點 [2]。除了作為疫苗抗原的表達模板外,mRNA 藥物還具有多種功能。首先,mRNA 可以作為癌癥治療的生物標志物 [9]。mRNA 直接或間接地影響體內細胞變化,發生相應的基因表達,反映組織的病理狀態。因此通過檢測細胞內 mRNA 的變化,可以為早期疾病的檢測提供線索和生理依據。其次,mRNA 動態檢測可作為組織檢測的有效補充,且在無癥狀人群中的檢測效率較高,可以對多種疾病進行診斷和評估,有潛力替代直接的組織取樣檢測 [9-10]。在上述 mRNA 藥 物 研 究 過 程 中, 對 體 內 外 mRNA 水平的準確檢測能反映基因的表達情況,時刻監測 mRNA 藥物的療效和毒性。因此快速、靈敏、特異性強的 mRNA 檢測方法非常重要。常見的 mRNA 檢測方法有:逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、恒溫擴增技術、細胞成像技術等(見圖 1)。在對mRNA的機理研究或將mRNA作為疾病的生物標志物,準確測定mRNA表達水平非常重要。mRNA的檢測技術已發展成為了獨立的研究領域,現已開發了多種檢測 mRNA 的技術,包括用放射性標記的探針進行 RNA 印跡分析[11],基于微陣列[12]和基于聚合酶鏈式反應(PCR)的方法[13],液相單細胞測定[14],原位雜交[15-16]和高通量測序[17]等。然而,這些方法都有其固有的局限性,但是檢測 mRNA 依然面臨著重大挑戰。對 體 內 外 mRNA 水平的準確檢測能反映基因的表達情況,時刻監測 mRNA 藥物的療效和毒性。因此快速、靈敏、特異性強的 mRNA 檢測方法非常重要。常見的 mRNA 檢測方法有:逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、恒溫擴增技術、細胞成像技術等(見圖 1)。。理想的 mRNA 測定應滿足幾個要求: 1)靈敏度足夠高,能夠檢測容量很少的樣品。2)能夠對mRNA 含量進行定量分析。3)特異性強,能夠檢測 mRNA之間的單核苷酸差異。4)操作簡易而不需要昂貴的試劑或設備[18]。5)能夠快速出結果。 Northern印跡法曾經是檢測mRNA的廣泛使用標準,可以檢測mRNA的相對分子大小和豐度,但其也存在低通量、耗時長、易降解等缺點,并且敏感度較低,無法檢測到分子量較低的mRNA。實時定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT- PCR)具有動態范圍大、靈敏度高、序列特異性強等優點,已成為檢測mRNA表達的常規和可靠技術。 但qRT-PCR測定的mRNA并非樣品的實際表達量,難于區分mRNA之間的單核苷酸差異,并且還有假陽性以及引物設計困難的問題。微陣列技術是一種快速、高通量檢測mRNAs的方法,但成本高,不能檢測分子量較低的mRNA,對序列相似的mRNA的分辨性不好,也有假陽性問題。為了推進mRNA檢測,一些學者開發了各種等溫分析技術,包括滾環擴增(RCA),指數擴增反應(EXPAR),環介導的等溫擴增(LAMP),雜交鏈反應和催化發夾組裝。盡管這些測定具有簡單甚至無需儀器操作的優點,但也存在限制其廣泛應用的缺點,例如EXPAR和LAMP的非特異性擴增和高背景信號,以及雜交鏈反應和催化發夾組裝的相對較慢的動力學和低靈敏度。微奧基因 生物技術公司開發的快速messageRNA Electrophoretic Fluorescence Assay (msREFA) 技術是檢測mRNA的有力工具。其工作原理是基于分子雜交,未雜交的探針比與RNA/DNA與探針的雜交體的分子量小,導致在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠中移動速度變化,游離探針與雜交體位置不同,探針在電泳膠中的位置通過熒光標記物在熒光掃描儀或成像儀顯現。msREFA具有以下優勢與特點。 1.靈敏度高:msREFA kits使用近紅外標記探針,并采用特殊方法大大提高檢測靈敏度,能夠測定飛克摩水平的mRNA(圖1,檢測靈敏度)。 2.快速出結果:msREFA技術能夠使分子雜交在20分鐘內完成,mRNA測定在2小時內完成(圖2,時間安排)。 3.操作簡便:msREFA在現有mRNA檢測方法中為最簡便的操作技術,簡單操作與快速出結果能大大降低樣品降解(見操作說明書)。 4.分辨率高:msREFA技術能夠區分mRNA前體與成熟mRNA(圖3。區分mRNA的分子大小(圖4),以及同種mRNA間的單個堿基變異(圖5)。 5.絕對量檢測:msREFA不涉及任何擴增,所測定的是單位樣品體積中的mRNA絕對量。 6.定量檢測:msREFA能夠對所測定的mRNA進行定量分析。在新冠病毒的檢測中,原位雜交技術也提供了一種快速檢測的思路。Wang 等 [36] 基于雜交捕獲熒光免疫測定(hybrid capture fluorescence immunoassay,HC-FIA)技術,將雜交和免疫熒光分析結合,開發出了一種新型無需擴增的 SARS-CoV-2 核酸檢測平臺,能夠在 1 h 內完成對 SARS-CoV-2 的檢測。首先,在反應管中,優化的 DNA 探針與 SARS-CoV-2 病毒基因組保守的開放閱讀框 1ab(ORF1ab)、包膜蛋白(E)和核衣殼(N)區域結合,形成 DNA-RNA 復合物,進而被熒光納米顆粒標記的 S9.6 抗體捕獲;然后,在免疫熒光分析階段,將 S9.6 抗體以及抗兔IgG 抗體分別噴涂在試紙條的測試線(T)和對照線(C)上,將反應液滴在樣品墊上,在毛細管張力的作用下,復合物到達 T 區,被 S9.6 抗體捕獲,逐漸產生熒光信號。在 C 區,熒光納米粒子(fluorescent nanoparticles,FNP)標記的兔 IgG 被抗兔 IgG 捕獲,也產生熒光;最后,使用熒光閱讀器讀取 T/C 熒光值來進行定量分析。相比當前常用的 qPCR 技術,這種新型技術的檢測限能達到每毫升 500 拷貝,且已被開發成用于診斷 SARS-CoV-2 的檢測試劑盒。

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