初次接觸EMSA的客戶可能出現EMSA試劑選擇困難。網上常看到有”如何選擇EMSA試劑“的求助。微奧基因團隊對EMSA技術有豐富經驗,對市場情況非常了解,以下意見供參考。
【A】選用EMSA試劑盒的一般原則。
1. 產品的成熟程度:產品在市場上有多少時間,有多少人用過。
2. 是否有完整EMSA產品鏈:做EMSA需要各種相關試劑。如果服務商本身都沒有條件做EMSA,可以認定所出售的
EMSA試劑盒根本沒經過檢驗。
3. 了解公司的技術力量:購貨前可聯系商家問些EMSA技術問題。如果商家的相關知識沒有客戶多,Forget
it !!!
4. 了解用戶滿意度:有多少人用過,滿意度怎么樣。
5.
是否有與產品相關的文章發表:盡管沒有文章不能證明產品好壞,但有相關文章發表肯定對試劑選擇有加分。
6. 不要混用幾家公司產品:因為 1)不同廠家的產品成分與配方各有不同,混合使用很可能不工作。2)會導致難于找出EMSA遇到的問題。3)如果結果不理想,都不知道向那家公司求助。
例如,某位客戶所用的樣品是鼠腦組織,EMSA試劑盒是碧云天的,核蛋白提取是Thermo的,探針序列是網上找的,Oligoes是生工合成,雙鏈探針是自己做的,用的是Minipore
Hypond膜,做實驗沒有陽性樣品對照。如果客戶測不出結合帶而求助,我們難提供有效幫助。
【B】EMSA產品比較。下表列出了市場上各種非放射性(發光)EMSA的優缺點,供參考。市場上天恩澤的“
【C】市場產品點評。
1. 關于Thermo的LightShift試劑盒
優點 -- 1)非放射,生物素/ECL系統,靈敏度高,2)適用于未 2.
關于Roche地高辛(DIG)標記EMSA試劑盒 優點 --
1)非放射性,2)適用于未知結合條件的TF測定,3)試劑量大,4)穩定,5)帶OCT2A陽性對照*。 3. 關于Signosis EMSA試劑盒
優點 -- 1)非放射性生物素/ECL系統,靈敏度高。2)帶探針與膜的即用型。 4. 關于碧云天化學發光EMSA試劑盒 優點 -- 1)非放射,生物素/ECL系統。2)價格低。
Poly[dI: dC]用量對轉錄因子結合的影響在分子生物學圣經 “Molecular Cloning,
A Laboratory Manual” 有詳細介紹。實際操作中,不管是我們做技術服務還是客戶自己做的EMSA測定都需經過一定優化。
5. 關于微奧基因 EMSA試劑盒
微奧基因 不像Thermo、Roche、Li Cor 那樣有名。但我們聚焦于轉錄因子活性檢測這一領域,所提供的相關產品類別最全、數量最多(產品列表)。產品線涵蓋了測定未知反應條件蛋白因子的通用型以及針對特定轉錄因子測定的即用型成套試劑(比較上面表格)。微奧基因的EMSA試劑盒對所測定的TF已經預實驗確定了測定條件,成功率高,價格有競爭性。地表上沒有哪家公司能夠提供種類繁多的陽性轉錄因子對照,以及種類繁多的近紅外熒光EMSA產品。
從測定靈敏度與易操作考慮,微奧基因的EMSA產品沒有基于DIG的測定系統。微奧基因不會提供單一反應液以及不能調整Poly[dI:
dC]用量的EMSA產品。大量文獻以及我們的實驗證實轉錄因子與DNA的結合在不同反應液中有明顯差別。實際上,許多客戶正是通過調整反應液成分以及Poly[dI:
dC]用量而獲得成功的。
微奧基因 提供各種轉錄因子活性檢測的技術服務(服務列表),使用我們產品與服務而發表文章有上千篇。
我們的技術支持一流,QQ:2941312161與微信:微奧基因 24小時開放。 【D】EMSA相關產品的選購(詳情)
LightShift
DIG-EMSA
EMSA kit
CoolShift
完全EMSA
完全EMSA+
生產廠商
Thermo
Roche
Signosis
微奧基因
結合反應液
+
+
+
+
+
+
Poly[dI: dC]
+
+1
+
+
+
+
Poly[dA: dT]
-
+1
-
-
-
-
Poly Lysine
-
+1
-
-
-
-
抗DIG抗體
-
+
-
-
-
-
DIG標記Kit
-
+
-
-
-
-
上樣液
+
+
+
+
+
+
親和素-HRP
+
-
+
+
+
+
發光底物
HRP
AKP
HRP
HRP
HRP
HRP
膜封閉液
+
+
+
+
+
+
膜洗液
+
-
+
+
+
+
HRP平衡液
+
-
+
+
+
+
生物素探針
-
-
+
-
+
+
專用轉運膜
-
-
+
-
+
+
MgCL28
+
-
-
+
-10
-10
KCL8
+
-
-
+
-10
-10
NP408
+
-
-
+
-10
-10
Glycerol8
+
-
-
+
-10
-10
EDTA8
+
-
-
+
-10
-10
BSA8
+
-
-
+
-10
-10
質控標記探針
+3
+4
-
+5
-
+5
競爭探針
-
-
-
option
option
+
突變探針
-
-
-
option
option
+
質控蛋白
+6
+7
-
option
option
option
陰性對照9
-
-
-
option
option
option
陽性對照9
-
-
-
option
option
option
EMSA預制膠
-
-
-
option
option
option
EMSA電泳液
-
-
-
option
option
option
測定樣品數
100
100
30
100
30/50
30/50
價格
~5000
~4500
~7000
1950
1942/2895
1942/2895
注1.
Roche 通過Poly[dI: dC]、Poly[dA: dT]與Poly
Lysine的用量來控制DIG
EMSA的背景與結合帶強弱。生物素與熒光EMSA通常是通過Poly[dI:
dC] 與優化劑8用量來控制EMSA的背景與結合帶強弱。
注3-5.
Thermo試劑配EBNA探針與EBNA6,Roche配OCT2A探針與OCT2A做試劑質控7,與客戶樣品的測定條件沒有關系。微奧基因的質控探針帶多個看家基因結合位點,能夠與客戶的核提取產生結合帶,除了用作試劑質控,還能直接確定客戶樣品質量。
注9.
微奧基因供應數十種與客戶待測轉錄因子相同的陽性/陰性對照。
注10.
有關成分已經整合到特定轉錄因子的反應液中。測定條件已經確定,不需要客戶再做優化。 知結合條件轉錄因子測定,3)試劑量大,4)穩定,5)帶EBNF陽性對照*。
缺點 --
1)價格貴,5000+元/套。2)非即用型;客戶需制備或另購探針。首次接觸EMSA的客戶自己設計制作的探針可能不工作。3)需摸索測定條件,會花費額外時間與錢財。以NFkB為例,用選配試劑做EMSA會出現多種結合帶型(右圖),結果難于判斷。4)不帶轉運膜,客戶需另購。常用的NC、PVDF與尼龍膜很可能做不出結果。
5)EBNF對照意義不大(下面解釋)。6)在國內難于獲得有力技術支持。
*EBNF對照用處不大,因為
1)EBNF分子很小,難于用作標準判斷樣品結合帶位置。2)EBNF反應條件與實際樣品非常不同。EMSA失敗一般是由于核蛋白丟失、蛋白降解、蛋白因子未活化、探針不結合或實驗條件受限等原因,但與EBNF有無結合沒有關系。3)理論上,測不出EBNF帶可能提示 電泳、轉膜、紫外交聯、酶反應、洗膜或ECL底物等環節出了問題。實際上,如果電泳、轉膜、紫外交聯、酶反應、洗膜或ECL底物等任何環節出問題,游離探針也就會看不到,因此,并沒有非用EBNF對照的理由。4)實際上、用于發表的圖是不會有EBNF帶的,有也需要裁剪掉。
缺點-- 為最早的非放射性EMSA試劑,但與后來開發的生物素/熒光EMSA相比,已沒有任何優勢。1)非即用型試劑盒,到貨后要標記探針,配制膜洗液與購買轉運膜等。2)貴;7000多一套,比任何EMSA試劑盒都貴。
3)工作量大;DIG標記手工進行,標記率低。相比之下,生物素/紅外熒光標記在機器合成核酸時進行,與訂購引物一樣簡單。
4)費時;手工標記探針需要兩天時間。此外、DIG發光檢測是基于半抗原/抗體反應,親和性低,需要2天才能見到結果。而生物素/親和素的結合比抗原/抗體強萬倍,~5小時左右就能出結果。近紅外熒光EMSA更將檢測時間縮短到~2小時。5)背景高;DIG的抗原/抗體反應只能在溫和條件下孵育。相比之下,生物素/親和素結合能經歷嚴苛的孵育與洗滌條件,圖譜更漂亮。
6)靈敏度低;DIG系統使用堿性磷酸酶(AKP)系統(說明書要求曝光15-30分鐘),其靈敏度遠不如HRP(曝光1-5分鐘)。如果使用成像儀,AKP的結果很難看到。
5)國內很難獲得技術支持。
缺點 -- 1)價格貴,4500元/30次測定。2)選擇有限,無法進行個性化或SNP測定。3)國內很難獲得技術支持。
缺點 --
1)非即用型,需要客戶自己設計/制作
或 購買探針(探針問題解釋)。2)客戶需另購轉運膜,常用的NC、PVDF膜等拿不到好結果。3)Poly[dI: dC]與反應液配為一體以及所有TF結合都使用單一反應液而不配優化試劑,是該產品最大的問題。因為做EMSA預實驗時,可能看不到或看到很弱的結合帶,常常需要調整Poly[dI: dC]用量與優化試劑成分才能獲得良好結果。但碧云天EMSA試劑盒不能對測定條件做任何調整。以常見的NFkB(右上圖)與AP-1
(右圖)EMSA為例,相同樣品與探針在不同反應液做EMSA結合反應,所測得的EMSA結果有很大差別。例如,兩圖中的第3泳道使用相同反應液,在AP-1圖中看不到結合帶(右圖最上帶),但在NFkB圖中出現高背景(右上圖最上帶為NFkB帶)。很明顯,使用單一反應液并不能調整反應條件,很可能導致失敗、信號弱、或出現無法解釋的結果。進一步把單一反應液用于成千上萬種轉錄因子/結合蛋白測定,問題會更加嚴重。的確,有不少碧云天用戶在網上反映做不出EMSA結果(QQ197845171
:EMSA專題討論)