為什么要做EMSA實驗,EMSA有什么用。
EMSA(Electronic Mobility Shift Assay) 是測定核酸(RNA/RNA)結合蛋白與目標分子結合活性的一種傳統技術。EMSA應用最多的是測定與雙鏈DNA特定序列結合的結合(查看EMSA工作原理)。
細胞轉錄因子參與基因的調節與控制,與生物體的生老病死都有關系。正常細胞有正常的轉錄因子活性,疾病時就出現異常。差不多每種癌癥細胞都有異常的轉錄因子結合。例如兒童淋巴性白血病大部分都有異常活化的NFkB。頭頸部腫瘤異常活化的STAT3很常見。
近年火熱的干細胞與誘導性干細胞技術都涉及到轉錄因子的作用:誘導體細胞向干細胞轉化的幾種基因與基因產物全部都是轉錄因子。
EMSA結合了電泳技術,能夠對發生結合的轉錄因子進行確認。相對而言,其它任何沒有結合電泳分離技術的測定方法,如基因(核酸)芯片,蛋白芯片,微孔板法轉錄因子結合測定,ChiP篩選測出的活化轉錄因子,都需要用EMSA進行確認。如右圖所示,EMSA測定中出現了6-7條帶。在EMSA測定中,第1與第3電泳道是STAT5陰性,但在生物芯片點陣或微孔板測定中,都會出現陽性信號。
EMSA是確認核酸結合蛋白活性的金指標,在可預見的相當時間內,EMSA都是對TF活性進行確認的不可替代的技術。
結合抗體的Super Shift EMSA是對多聚合體的成分進行鑒定。EMSA結合報告基因的測定能夠確認所涉及到的基因調節控制。</5>
EMSA測定的轉錄因子活性是細胞信號傳導通路的重要環節,任何信號傳導都會與轉錄因子激活連接并且啟動轉錄過程。信號通路中的分子磷酸化有時并沒有EMSA可檢測的核內轉錄因子,后來用免疫熒光證明核內根本沒有NFkB的核轉運。
隨著測定技術的改進,非放射性EMSA能夠比放射性同位素標記的方法(要4-5天出結果)更快出結果,而且比大多數信號傳導通路分子的分析方式更快出結果。利用微奧基因的產品與技術(查看相關技術與產品),EMSA測定最快可以在2-2.5小時完成(查看),靈敏度也超過用放射性同位素標記的方法。