• 一、為什么需要EMSA陰性陽性對照

  

• 通過電泳技術確定目標分子位置時，一般都會放分子量參考物。Western Blotting （WB）使用蛋白分子量Marker，DNA/RNA電泳使用DNA/RNA 分子量Markers 來確定目標分子的位置。 在蛋白與核酸電泳分析中不用Marker會導致無法確認目標分子。同樣，在EMSA測定中，不用參照物會造成結果分析困難。

• EMSA是用非變性膠來分析天然蛋白遷移率。在非變性膠中的蛋白遷移率受許多因素影響；

1）蛋白分子量大的移動慢。但由于EMSA的PAGE 膠濃度很低（相對于WB的濃縮膠），對大蛋白的分離遠不及WB。
2）天然蛋白質的3D構型會影響電泳遷移率；小的絲狀蛋白可能比分子量大很多的球形蛋白移動慢。
3）蛋白質所帶電荷的極性與強弱會影響電泳遷移率; 帶負電荷多的移動快。
4）蛋白與蛋白結合會遷移率；如多數轉錄因子都需與別蛋白結合而發揮作用。
5）蛋白與不同類型探針結合遷移率會有差別。非放射性標記探針的標記物也會影響目標蛋白遷移率。

• 二、如何制備或獲得EMSA對照

• 做EMSA的目的不是用來判斷目標蛋白大小，而是找出核酸/蛋白復合物的位置。因而，在EMSA膠中放分子量Marker沒有用，也不能WB的Marker。 一般會在實驗時，同時進行EMSA陰性陽性對照的結合反應，一起跑電泳。制備EMSA對照，尤其陽性對照，可以參照文獻，采用大家公認的方式進行并且經過EMSA確認。

  以我們做的NFkB對照為例，陽性對照的制備如下；培養Mo7e細胞3天左右，頭天放無血清培養基過夜，第二天上午用腫瘤壞死因子（TNF-a）處理1小時，然后抽提核蛋白， 測定蛋白濃度，做NFkB的EMSA分析。陽性樣品分裝后放-80oC保存。即使這樣處理，仍然有25%的幾率，NFkB的EMSA結果為陰性，可能與細胞生長有關。

  三、如果選擇EMSA對照

  （1）如有可能，盡量選用與實驗蛋白因子相同的EMSA對照，有以下好處；1）能夠準確指示目標帶的位置，2）使用相同探針有助于確定實驗條件，3）容易找出EMSA測定中的問題，4）帶陰陽對照的圖譜可以一起發表。

  （2）當制備與實驗蛋白因子相同的對照不易或不可行時，也可采用以結合蛋白位置相近的已知陽性結合蛋白做對照（實際上，WB與核酸電泳中的分子Marker都實驗樣品不同）， 但陽性對照與實驗樣品的物種來源不要差別太大。對動物與人的許多轉錄因子而言，陽性結合帶都會出現在特定區域，許多都可以互作對照。如果客戶對位置判斷有問題，微奧基因可以協助解決。

  （3）如果陽性對照的結合帶位置與EMSA目標分子差別很大，作為陽性對照的意義不大。Thermo公司的Lightshift 中的EBNF陽性對照就沒有什么實際意義；

  1）EBNF結合帶位置比非特異結合帶都低，位于游離探針上面一點，不能幫助判斷絕大多數DNA/RNA結合蛋白的位置。
  2）EBNF對照所用探針與樣品與實驗測定完全不一樣。EMSA實驗結果未達預期可能是由于核蛋白丟失，蛋白降解，蛋白因子未活化，探針不結合等原因，但與EBNF對照有無結合帶出現半毛錢關系都沒有。
  3）在同一片膠中用EBNF對照的理由是可確定電泳與測定系統是否工作。理論上，如果跑電泳，轉膜，紫外交聯，Biotin/Avidin反應，或ECL底物出問題，就可能看不到EBNF結合帶。但實際上，出現上述問題時，游離探針也會看不到，何必要看EBNF帶。
  4）在把實驗圖用于文章發表時，需要將EBNF對照帶切掉。如果用于發表的圖中實驗樣品都有了結合帶，還用得著用EBNF對照來證明EMSA檢測系統是否工作嗎？！

  四、微奧基因的EMSA對照與價格

  微奧基因所有的陽性與陰性對照的數量與類別為業界最全，所有的陽性與陰性對照都經過EMSA測定，保證品質。現有的陽陰性對照有NFkB，AP1，SP1，OCT1，OCT2，OCT2，NRF2，GATA，STATs，WT-1，EF2，P53，GLI，Burnx1等...