【Pulldown類別】
A. 依據實驗目的是為了鑒定DNA結合蛋白或RNA結合蛋白,Pulldown分為DNA Pulldown 與RNA Pulldown兩類,這個不難理解。
B. 依據標記探針的結合對象,Pulldown可分為直接法與間接法兩類:如果短鏈標記探針與蛋白直接結合并對所抓取的蛋白進行分析鑒定的實驗稱 為直接Pulldown。如果短鏈標記探針不與蛋白質直接結合,而是通過分子雜交與目標DNA/RNA結合,分析鑒定與目標DNA/RNA結合的 蛋白質分子的方法稱為間接Pulldown。
直接法Pulldown是檢查已知結合序列的探針與相應結合蛋白的結合,檢測意義與EMSA相似,但可準確確定核酸/蛋白復合物的組分以及結合蛋白家族成員的亞單位。
間接法Pulldown可用于;
1探測與長鏈DNA或RNA分子結合的已知或未知蛋白。
2)確定與長鏈DNA或RNA分子結合的多種蛋白成分,
3)用于分析與各種非編碼RNA(circRNA、lncRNA、eRNA等)或DNA結合的蛋白。
C. Pulldown所抓取蛋白可以通過 1)對解離液進行質譜(Liquid-MS),2)可以通過WB進行鑒定,或 3)先用SDS PAGE 或雙向電泳分離,再考馬斯亮藍染色,用從染色膠上切蛋白帶進行質譜鑒定(Gel-MS)。我們將這三種抓取蛋白的鑒定方法,分別稱為 Pulldown-LM,Pulldown-WB 與 Pulldown-GM,以示區別。
【直接與間接Pulldown的比較】見下表:
直接Pulldown
間接Pulldown
DNA
RNA
DNA
RNA
短探針
長探針
短探針
長探針
標記探針類型
合成、雙鏈
長雙鏈
合成單鏈
長單鏈
合成單鏈
合成單鏈
與目標蛋白反應
結合
結合
結合
結合
不結合
不結合
純化長鏈核酸
不需要
需要
不需要
需要
不需要
不需要
核酸結合序列
已知
一般未知
已知
一般未知
一般未知
一般未知
結合蛋白樣品
必須
必須
必須
必須
必須
必須
蛋白核酸結合序列
確定
可能確定*
確定
可能確定
可能確定*
可能確定*
結合蛋白數量
單個
一般多個
單個
一般多個
單個或多個
單個或多個
反應溫度
室溫/37oC
室溫/37oC
室溫/37oC
室溫/37oC
雜交后37oC**
雜交后37oC**
注*;可以通過將中介核酸分子逐步縮短的方式確定結合區域或序列。注**;