一、經典放射性EMSA技術
EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay, 凝膠遷移或電泳遷移率實驗)是一種研究核酸(DNA/RNA)結合蛋白活性的經典技術, 可用于定性和定量分析。這一技術最初用于研究DNA結合蛋白,目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常將純化蛋白或細胞粗提液和P32同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫,在非變性的聚丙烯凝膠電泳上, 分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同, 可是雙鏈或者是單鏈。當檢測 如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白,可用純化蛋白,部分純化蛋白,或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時, 依據目的RNA結合蛋白的位置,可用純化或部分純化的蛋白,也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或 RNA片段和寡核苷酸片段(特異), 和其它非相關的片段(非特異),來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下,依據復合物的特點和強度來確定特異結合。
EMSA原理如右邊示意圖:
二、非放射性EMSA(Non-radioactive EMSA)技術
由于放射性同位素在使用、存放與操作上的問題,非放射性EMSA得到了廣泛運用。隨著檢測技術的不斷進步, 非放射性EMSA的檢測靈敏度已經超過了放射性EMSA;放射性EMSA需要對感光膠片曝光1-2天才能夠看到清晰圖像,而ECL EMSA 或近紅外熒光EMSA都能夠在1-3分鐘獲得結果。
非放射性EMSA的工作原理與放射性EMSA相同,但所用DNA/RNA探針的特性有很大不同,操作步驟有很大區別。
1)非放射性標記探針需要仔細設計與制作 P32放射性同位素用于標記的探針時,是代替核酸中的P31,兩者的差別只有一個電子。放射性探針對核酸的影響微乎其微。 非放射性EMSA有采用對非標記探針進行染色的技術,如Invitrogen的。但因其靈敏度低而且還只能用于純化的樣品, 實驗受限。常用的非放射性EMSA常用生物素,地高辛或熒光素標記的探針。這些標記會對探針產生較大影響,而致EMSA測定失敗(見非放射性探針問題)。
2)非放射性EMSA與放射性EMSA操作有很大不同。EMSA的成功與很多因素有關,任何一個環節出錯都可以導致實驗失敗(請見EMSA常見問題與解決措施)
1. Briggs M R et al 1986 Science 234, 47.
2. Lee W et al
1986 Cell 49, 741. ·
3. Williams T et al 1989 Genes Dev
2, 1557. ·
4. Sen R and Baltimore D 1986 Cell 46, 705.
·
5. Parlsow T G et al 1984 Proc Natl Acad Sci USA 81,
2650. ·
6. Montminy M R et al 1986 Proc Natl Acad Sci
USA 83, 6682.