一、EMSA對樣品的要求。

做EMSA要求樣品中有天然的，有活性，可檢測量的完整DNA/RNA結合蛋白（結合蛋白）。樣品中沒有合用的結合蛋白，EMSA就是無的放矢。

二、EMSA樣品的類型。

EMSA測定的一大優點就是可以從核抽提液中測出相應的結合蛋白，而不需對目標蛋白進行純化。如果細胞或組織有持續活化的結合蛋白，樣品可以是胞漿液或全細胞溶胞液。EMSA樣品也可以是純化或部分純化的蛋白，甚至使用體外翻譯系統（一般用麥胚抽提物作哺乳細胞轉錄因子（TF）的體外翻譯）。不管采用什么樣品，其中的結合蛋白都必須有DNA/RNA結合活性才行，

三、EMSA樣品的常見問題

1. 沒有DNA/RNA結合蛋白

準備樣品前，最好查文獻確認所用的細胞或組織有沒有目標分子。沒有目標分子的細胞或組織需要導入外源性的表達載體，并測定目標分子的表達量。

2. DNA/RNA結合蛋白沒有被活化

細胞沒有活化的TF可有以下原因：1）大多數TF在細胞內都處于沒有活性的狀況。2）經過生物、理化因子刺激而活化的TF僅持續一定時間，幾個小時又轉為陰性。3）細胞刺激時間與劑量有誤，也不能活化TF。4）即使刺激方式與時間正確，一些細胞可能缺乏相應表面受體或細胞內效應分子而無法活化TF。

TF活化涉及一系列生物化學反應，包括蛋白磷酸化反應，蛋白質降解，多聚體形成，核轉運等。一般還涉及到其它調節蛋白的參與。依據不同的實驗以及不同刺激方式，對細胞的處理時間與藥物的處理劑量會有所不同，一般可以通過查看文獻來確定。如果使用微奧基因的EMSA產品與服務，我們會結合客戶的情況提出具體建議，成功率會高很多。

3. 樣品中的結合蛋白被降解

處理細胞，應當在低溫下操作，所有緩沖液與溶液都應預冷，并帶蛋白酶抑制劑。制備好的樣品需要在深低溫保存。

4. 結合蛋白在純化過程中失活

在細菌中表達目標蛋白，一些會變成不溶性，復性過程可能影響蛋白活性。因為很多結合因子在多聚體條件下才有活性，復性過程可使目標蛋白因子解聚而喪失活性。

5. 在細菌中表達的蛋白沒有活性

一些蛋白因子的活性涉及到翻譯后修飾，如多糖鏈等。當這些蛋白因子在細菌表達，細菌體系不能對表達分子進行相應修飾。這種情況下，即使表達的蛋白是可溶的并有恰當的立體天然構型，但不具有DNA/RNA結合的活性。

    

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