【產品包裝與價格】

產品類別	目錄號	規格	價格	描述
DNA-Prot. Pulldwon	SINP020 SINP021	10次 20次	2995元 4542元	包括DNA Pulldown試劑、結合蛋白分離試劑、凝膠電泳與染色試劑、詳細操作說明（隨試劑發貨）。
RNA-Prot. Pulldwon	SINP022 SINP023	10次 20次	3995元 6592元	包括RNA Pulldown試劑、結合蛋白分離試劑、凝膠電泳與染色試劑、詳細操作說明（隨試劑發貨）。
注：（1）訂貨須在目錄號后加規格。（2）微奧基因還提供DNA-protein與RNA-protein pulldown 服務（查看）。

【工作原理】

DNA-protein Pulldown/Pull-down試劑盒用于從組織與細胞樣品中純化DNA-結合蛋白。其工作原理為；

鏈親和素磁珠能夠與生物素標記DNA/蛋白復合物結合。在磁場下或通過離心使結合物與上清液分離，吸棄上清液并洗滌磁珠，然后用SDS樣品液使蛋白變性而與磁珠分離。分離液中的蛋白質用SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或雙向電泳分離，SDS PAGE用高靈敏度考馬斯亮藍（CBB）染色。然后從染色膠上切下所需蛋白帶進行質譜分析，確認蛋白種類與類型。

主要操作步驟見右邊圖1與圖2。

【產品特點】

1. 結合反應特異性高，非特異結合少。

2. SDS PAGE 染色帶清晰、銳利。

3. 染色靈敏度高，可以純化很少量的DNA結合蛋白（圖3）。

4. Pulldown的蛋白適合質譜分析。

【試劑盒組份】

1. 鏈親和素磁珠。

2. 生物素標記質控DNA探針。

3. DNA-蛋白或RNA-蛋白結合反應液。

4. DNA或RNA親和純化洗液。

5. SDS 樣品液。

6. SDS PAGE 預制膠

7. SDS PAGE 染色液。

8. SDS PAGE 脫色液。

9. 操作說明書。

【需要的其它設備與材料】

參考產品使用說明書

【適用范圍】

1. 鑒定未知DNA/RNA結合蛋白；在一些情況下（如 Circle-RNA、lncRNA等），可能并不知道與DNA/RNA結合的有哪些蛋白、是些什么蛋白。使用本試劑盒結合質譜分析能夠對未知結合蛋白進行鑒定，不需要使用純化蛋白或抗體。

2. 鑒定DNA結合蛋白的組份；許多轉錄因子都是多種蛋白的多聚體。例如NFkB有P65，P52，P50，C-rel 和Rel-B 5種亞單位。活化的NFkB為相同或不同亞單位之間的二聚體，鑒定NFkB的亞單位常用Supershift （超遷移）EMSA，需要使用針對各種NFkB亞單位的抗體，價格不菲。使用試劑盒可以NFkB亞單位代替Supershift （超遷移）EMSA 對DNA-蛋白復合物的亞單位進行鑒定，不需使用任何抗體。

3. 鑒定DNA結合蛋白與其它蛋白的相互作用 ；一些轉錄因子與DNA的結合還需要一些不與DNA結合蛋白的參與。使用本產品能夠同時對DNA結合蛋白與非DNA結合蛋白進行鑒定。

【注意事項】

1. 本試劑能夠與微奧基因的EMSA成套試劑無縫銜接。但如果使用Thermo，Signosis或碧云天的EMSA試劑，可能達不到理想效果或導致完全失敗。其原因是因為不同廠家所用的結合反應液成分不同，不同反應液對同一種轉錄因子的測定會有明顯差異（見圖4）。

2. 使用本產品前，建議先進行常規EMSA測定。EMSA測定可以提供以下信息；

1）有沒有在EMSA測定中看到DNA與蛋白的結合帶。明顯的EMSA結合帶預示好的鑒定結果。

2）EMSA結合帶的強弱提示Pulldown的反應體積；結合帶強、樣品核蛋白用量少，反應體系體積小。

3）EMSA測定中有沒有非特異條帶或高背景；如果非特異條帶明顯，需要使用相同細胞株的陰性對照來確定純化后的非特異帶譜。

3. 請嚴格按照操作手冊進行操作。如果遇到問題，請用生物素標記質控探針與核蛋白樣品進行Pulldown 實驗。生物素標記質控探針所測定的DNA結合蛋白存在于幾乎所有細胞核中，Pulldown的上清液在用考馬斯亮藍染色的PAGE膠中，應會看到為蛋白帶。陰性結果提示 1）樣品中核蛋白降解核蛋白，2）用于pulldown的核蛋白總量不夠，3）樣品中的核蛋白濃度太稀，4）核蛋白在提取過程中丟失，提示需要重新制作核蛋白樣品并做結合蛋白的EMSA鑒定。

 

 

 

 

 

 

Pic. 3, 20ul、10ul、5ul、2.5 ul、1.25ul 細胞裂解液重復加入SDS PAGE膠。電泳后，凝膠板切成左右兩片，分別用微奧基因與Thermo的考馬斯亮藍（CBB）染色。
Pic. 4, 用鏈親和素磁珠Pulldwon 的DNA-結合蛋白（電泳道1-5用微奧基因 CBB染色，電泳道6-7用碧*天CBB染色）：1，從EMSA測定陽性的樣品pulldown的未知結合蛋白，2，EMSA測定陰性樣品的pulldown結果。泳道2使用與泳道1相同細胞株，但細胞沒有經過激活處理。3與4，為NFkB EMSA 陽性與陰性樣品的pulldown結果。結合質譜分析，能夠鑒定NFkB的亞單位。5，蛋白分子Marker。6與7，樣品與pulldown操作與泳道3與4相同。Pulldown蛋白經SDS-PAGE分析，用碧*天CBB染色。