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mRNA_lncRNA
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T許多年來,一直都不是很清楚非編碼的長RNA(LncRNA)有什么作用,近幾年的研究發(fā)現(xiàn)LncRNA(mRNA)在基因調(diào)控方面發(fā)揮了重要作用。 mRNA疫苗在抗新冠疫情中取得的成功是mRNA作為新型治療藥物的概念興起,由 mRNA 編碼出的抗原決定簇不僅數(shù)量眾多且類型豐富 [1-3]。與 DNA 藥物相比,mRNA 藥物不會(huì)插入基因組之中 [2-8],可通過正常代謝途徑分解,安全性更高 [5-6];mRNA 藥物無需進(jìn)入細(xì)胞核便可發(fā)揮其功能,既可以通過體外轉(zhuǎn)錄,也能夠在患者體內(nèi)合成所需的治療性蛋白質(zhì),設(shè)計(jì)和起效更加靈活快速。 為個(gè)性化治療開辟了新的道路;mRNA 疫苗編碼的蛋白可通過激活免疫細(xì)胞觸發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng),可用于癌癥免疫治療、傳染病疫苗或蛋白質(zhì)替代等生物醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 [7]。目前,針對晚期黑色素瘤的 mRNA 疫苗Ⅰ期臨床試驗(yàn)已經(jīng)完成 [8]。此外,新冠肺炎 mRNA 疫苗的開發(fā)與研究也成為近期研究的熱點(diǎn) [2]。 除了作為疫苗抗原的表達(dá)模板外,mRNA 藥物還具有多種功能。首先,mRNA 可以作為癌癥治療的生物標(biāo)志物 [9]。mRNA 直接或間接地影響體內(nèi)細(xì)胞變化,發(fā)生相應(yīng)的基因表達(dá),反映組織的病理狀態(tài)。因此通過檢測細(xì)胞內(nèi) mRNA 的變化,可以為早期疾病的檢測提供線索和生理依據(jù)。其次,mRNA 動(dòng)態(tài)檢測可作為組織檢測的有效補(bǔ)充,且在無癥狀人群中的檢測效率較高,可以對多種疾病進(jìn)行診斷和評估,有潛力替代直接的組織取樣檢測 [9-10]。 在上述 mRNA 藥 物 研 究 過 程 中, 對 體 內(nèi) 外 mRNA 水平的準(zhǔn)確檢測能反映基因的表達(dá)情況,時(shí)刻監(jiān)測 mRNA 藥物的療效和毒性。因此快速、靈敏、特異性強(qiáng)的 mRNA 檢測方法非常重要。常見的 mRNA 檢測方法有:逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、細(xì)胞成像技術(shù)等(見圖 1)。 在對mRNA的機(jī)理研究或?qū)RNA作為疾病的生物標(biāo)志物,準(zhǔn)確測定mRNA表達(dá)水平非常重要。mRNA的檢測技術(shù)已發(fā)展成為了獨(dú)立的研究領(lǐng)域,現(xiàn)已開發(fā)了多種檢測 mRNA 的技術(shù),包括用放射性標(biāo)記的探針進(jìn)行 RNA 印跡分析[11],基于微陣列[12]和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法[13],液相單細(xì)胞測定[14],原位雜交[15-16]和高通量測序[17]等。然而,這些方法都有其固有的局限性,但是檢測 mRNA 依然面臨著重大挑戰(zhàn)。 對 體 內(nèi) 外 mRNA 水平的準(zhǔn)確檢測能反映基因的表達(dá)情況,時(shí)刻監(jiān)測 mRNA 藥物的療效和毒性。因此快速、靈敏、特異性強(qiáng)的 mRNA 檢測方法非常重要。常見的 mRNA 檢測方法有:逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、細(xì)胞成像技術(shù)等(見圖 1)。。 理想的 mRNA 測定應(yīng)滿足幾個(gè)要求: 1)靈敏度足夠高,能夠檢測容量很少的樣品。2)能夠?qū)RNA 含量進(jìn)行定量分析。3)特異性強(qiáng),能夠檢測 mRNA之間的單核苷酸差異。4)操作簡易而不需要昂貴的試劑或設(shè)備[18]。5)能夠快速出結(jié)果。 Northern印跡法曾經(jīng)是檢測mRNA的廣泛使用標(biāo)準(zhǔn),可以檢測mRNA的相對分子大小和豐度,但其也存在低通量、耗時(shí)長、易降解等缺點(diǎn),并且敏感度較低,無法檢測到分子量較低的mRNA。 實(shí)時(shí)定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT- PCR)具有動(dòng)態(tài)范圍大、靈敏度高、序列特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),已成為檢測mRNA表達(dá)的常規(guī)和可靠技術(shù)。 但qRT-PCR測定的mRNA并非樣品的實(shí)際表達(dá)量,難于區(qū)分mRNA之間的單核苷酸差異,并且還有假陽性以及引物設(shè)計(jì)困難的問題。 微陣列技術(shù)是一種快速、高通量檢測mRNAs的方法,但成本高,不能檢測分子量較低的mRNA,對序列相似的mRNA的分辨性不好,也有假陽性問題。 為了推進(jìn)mRNA檢測,一些學(xué)者開發(fā)了各種等溫分析技術(shù),包括滾環(huán)擴(kuò)增(RCA),指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(EXPAR),環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP),雜交鏈反應(yīng)和催化發(fā)夾組裝。盡管這些測定具有簡單甚至無需儀器操作的優(yōu)點(diǎn),但也存在限制其廣泛應(yīng)用的缺點(diǎn),例如EXPAR和LAMP的非特異性擴(kuò)增和高背景信號,以及雜交鏈反應(yīng)和催化發(fā)夾組裝的相對較慢的動(dòng)力學(xué)和低靈敏度。 Viagene 生物技術(shù)公司開發(fā)的快速messageRNA Electrophoretic Fluorescence Assay (msREFA) 技術(shù)是檢測mRNA的有力工具。其工作原理是基于分子雜交,未雜交的探針比與RNA/DNA與探針的雜交體的分子量小,導(dǎo)致在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠中移動(dòng)速度變化,游離探針與雜交體位置不同,探針在電泳膠中的位置通過熒光標(biāo)記物在熒光掃描儀或成像儀顯現(xiàn)。msREFA具有以下優(yōu)勢與特點(diǎn)。 1.靈敏度高:msREFA kits使用近紅外標(biāo)記探針,并采用特殊方法大大提高檢測靈敏度,能夠測定飛克摩水平的mRNA(圖1,檢測靈敏度)。 2.快速出結(jié)果:msREFA技術(shù)能夠使分子雜交在20分鐘內(nèi)完成,mRNA測定在2小時(shí)內(nèi)完成(圖2,時(shí)間安排)。 3.操作簡便:msREFA在現(xiàn)有mRNA檢測方法中為最簡便的操作技術(shù),簡單操作與快速出結(jié)果能大大降低樣品降解(見操作說明書)。 4.分辨率高:msREFA技術(shù)能夠區(qū)分mRNA前體與成熟mRNA(圖3。區(qū)分mRNA的分子大?。▓D4),以及同種mRNA間的單個(gè)堿基變異(圖5)。 5.絕對量檢測:msREFA不涉及任何擴(kuò)增,所測定的是單位樣品體積中的mRNA絕對量。 6.定量檢測:msREFA能夠?qū)λ鶞y定的mRNA進(jìn)行定量分析。 在新冠病毒的檢測中,原位雜交技術(shù)也提供了一種快速檢測的思路。Wang 等 [36] 基于雜交捕獲熒光免疫測定(hybrid capture fluorescence immunoassay,HC-FIA)技術(shù),將雜交和免疫熒光分析結(jié)合,開發(fā)出了一種新型無需擴(kuò)增的 SARS-CoV-2 核酸檢測平臺(tái),能夠在 1 h 內(nèi)完成對 SARS-CoV-2 的檢測。首先,在反應(yīng)管中,優(yōu)化的 DNA 探針與 SARS-CoV-2 病毒基因組保守的開放閱讀框 1ab(ORF1ab)、包膜蛋白(E)和核衣殼(N)區(qū)域結(jié)合,形成 DNA-RNA 復(fù)合物,進(jìn)而被熒光納米顆粒標(biāo)記的 S9.6 抗體捕獲;然后,在免疫熒光分析階段,將 S9.6 抗體以及抗兔IgG 抗體分別噴涂在試紙條的測試線(T)和對照線(C)上,將反應(yīng)液滴在樣品墊上,在毛細(xì)管張力的作用下,復(fù)合物到達(dá) T 區(qū),被 S9.6 抗體捕獲,逐漸產(chǎn)生熒光信號。在 C 區(qū),熒光納米粒子(fluorescent nanoparticles,F(xiàn)NP)標(biāo)記的兔 IgG 被抗兔 IgG 捕獲,也產(chǎn)生熒光;最后,使用熒光閱讀器讀取 T/C 熒光值來進(jìn)行定量分析。相比當(dāng)前常用的 qPCR 技術(shù),這種新型技術(shù)的檢測限能達(dá)到每毫升 500 拷貝,且已被開發(fā)成用于診斷 SARS-CoV-2 的檢測試劑盒。
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