T許多年來，一直都不是很清楚非編碼的長RNA（LncRNA）有什么作用,近幾年的研究發(fā)現(xiàn)LncRNA（mRNA)在基因調(diào)控方面發(fā)揮了重要作用。 mRNA疫苗在抗新冠疫情中取得的成功是mRNA作為新型治療藥物的概念興起，由 mRNA 編碼出的抗原決定簇不僅數(shù)量眾多且類型豐富 [1-3]。與 DNA 藥物相比，mRNA 藥物不會(huì)插入基因組之中 [2-8]，可通過正常代謝途徑分解，安全性更高 [5-6]；mRNA 藥物無需進(jìn)入細(xì)胞核便可發(fā)揮其功能，既可以通過體外轉(zhuǎn)錄，也能夠在患者體內(nèi)合成所需的治療性蛋白質(zhì)，設(shè)計(jì)和起效更加靈活快速。 為個(gè)性化治療開辟了新的道路；mRNA 疫苗編碼的蛋白可通過激活免疫細(xì)胞觸發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，可用于癌癥免疫治療、傳染病疫苗或蛋白質(zhì)替代等生物醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 [7]。目前，針對晚期黑色素瘤的 mRNA 疫苗Ⅰ期臨床試驗(yàn)已經(jīng)完成 [8]。此外，新冠肺炎 mRNA 疫苗的開發(fā)與研究也成為近期研究的熱點(diǎn) [2]。 除了作為疫苗抗原的表達(dá)模板外，mRNA 藥物還具有多種功能。首先，mRNA 可以作為癌癥治療的生物標(biāo)志物 [9]。mRNA 直接或間接地影響體內(nèi)細(xì)胞變化，發(fā)生相應(yīng)的基因表達(dá)，反映組織的病理狀態(tài)。因此通過檢測細(xì)胞內(nèi) mRNA 的變化，可以為早期疾病的檢測提供線索和生理依據(jù)。其次，mRNA 動(dòng)態(tài)檢測可作為組織檢測的有效補(bǔ)充，且在無癥狀人群中的檢測效率較高，可以對多種疾病進(jìn)行診斷和評估，有潛力替代直接的組織取樣檢測 [9-10]。 在上述 mRNA 藥 物 研 究 過 程 中， 對 體 內(nèi) 外 mRNA 水平的準(zhǔn)確檢測能反映基因的表達(dá)情況，時(shí)刻監(jiān)測 mRNA 藥物的療效和毒性。因此快速、靈敏、特異性強(qiáng)的 mRNA 檢測方法非常重要。常見的 mRNA 檢測方法有：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、細(xì)胞成像技術(shù)等（見圖 1）。 在對mRNA的機(jī)理研究或?qū)RNA作為疾病的生物標(biāo)志物，準(zhǔn)確測定mRNA表達(dá)水平非常重要。mRNA的檢測技術(shù)已發(fā)展成為了獨(dú)立的研究領(lǐng)域，現(xiàn)已開發(fā)了多種檢測 mRNA 的技術(shù)，包括用放射性標(biāo)記的探針進(jìn)行 RNA 印跡分析[11]，基于微陣列[12]和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法[13]，液相單細(xì)胞測定[14]，原位雜交[15-16]和高通量測序[17]等。然而，這些方法都有其固有的局限性，但是檢測 mRNA 依然面臨著重大挑戰(zhàn)。 對 體 內(nèi) 外 mRNA 水平的準(zhǔn)確檢測能反映基因的表達(dá)情況，時(shí)刻監(jiān)測 mRNA 藥物的療效和毒性。因此快速、靈敏、特異性強(qiáng)的 mRNA 檢測方法非常重要。常見的 mRNA 檢測方法有：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、細(xì)胞成像技術(shù)等（見圖 1）。。 理想的 mRNA 測定應(yīng)滿足幾個(gè)要求: 1）靈敏度足夠高，能夠檢測容量很少的樣品。2）能夠?qū)RNA 含量進(jìn)行定量分析。3）特異性強(qiáng)，能夠檢測 mRNA之間的單核苷酸差異。4）操作簡易而不需要昂貴的試劑或設(shè)備[18]。5）能夠快速出結(jié)果。 Northern印跡法曾經(jīng)是檢測mRNA的廣泛使用標(biāo)準(zhǔn)，可以檢測mRNA的相對分子大小和豐度，但其也存在低通量、耗時(shí)長、易降解等缺點(diǎn)，并且敏感度較低，無法檢測到分子量較低的mRNA。 實(shí)時(shí)定量PCR(quantitativereal-timePCR，qRT- PCR)具有動(dòng)態(tài)范圍大、靈敏度高、序列特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為檢測mRNA表達(dá)的常規(guī)和可靠技術(shù)。 但qRT-PCR測定的mRNA并非樣品的實(shí)際表達(dá)量，難于區(qū)分mRNA之間的單核苷酸差異，并且還有假陽性以及引物設(shè)計(jì)困難的問題。 微陣列技術(shù)是一種快速、高通量檢測mRNAs的方法，但成本高，不能檢測分子量較低的mRNA，對序列相似的mRNA的分辨性不好，也有假陽性問題。 為了推進(jìn)mRNA檢測，一些學(xué)者開發(fā)了各種等溫分析技術(shù)，包括滾環(huán)擴(kuò)增（RCA），指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（EXPAR），環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（LAMP），雜交鏈反應(yīng)和催化發(fā)夾組裝。盡管這些測定具有簡單甚至無需儀器操作的優(yōu)點(diǎn)，但也存在限制其廣泛應(yīng)用的缺點(diǎn)，例如EXPAR和LAMP的非特異性擴(kuò)增和高背景信號，以及雜交鏈反應(yīng)和催化發(fā)夾組裝的相對較慢的動(dòng)力學(xué)和低靈敏度。 Viagene 生物技術(shù)公司開發(fā)的快速messageRNA Electrophoretic Fluorescence Assay (msREFA) 技術(shù)是檢測mRNA的有力工具。其工作原理是基于分子雜交，未雜交的探針比與RNA/DNA與探針的雜交體的分子量小，導(dǎo)致在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠中移動(dòng)速度變化，游離探針與雜交體位置不同，探針在電泳膠中的位置通過熒光標(biāo)記物在熒光掃描儀或成像儀顯現(xiàn)。msREFA具有以下優(yōu)勢與特點(diǎn)。 1.靈敏度高：msREFA kits使用近紅外標(biāo)記探針，并采用特殊方法大大提高檢測靈敏度，能夠測定飛克摩水平的mRNA（圖1，檢測靈敏度）。 2.快速出結(jié)果：msREFA技術(shù)能夠使分子雜交在20分鐘內(nèi)完成，mRNA測定在2小時(shí)內(nèi)完成（圖2，時(shí)間安排）。 3.操作簡便：msREFA在現(xiàn)有mRNA檢測方法中為最簡便的操作技術(shù)，簡單操作與快速出結(jié)果能大大降低樣品降解（見操作說明書）。 4.分辨率高：msREFA技術(shù)能夠區(qū)分mRNA前體與成熟mRNA（圖3。區(qū)分mRNA的分子大?。▓D4），以及同種mRNA間的單個(gè)堿基變異（圖5）。 5.絕對量檢測：msREFA不涉及任何擴(kuò)增，所測定的是單位樣品體積中的mRNA絕對量。 6.定量檢測：msREFA能夠?qū)λ鶞y定的mRNA進(jìn)行定量分析。 在新冠病毒的檢測中，原位雜交技術(shù)也提供了一種快速檢測的思路。Wang 等 [36] 基于雜交捕獲熒光免疫測定（hybrid capture fluorescence immunoassay，HC-FIA）技術(shù)，將雜交和免疫熒光分析結(jié)合，開發(fā)出了一種新型無需擴(kuò)增的 SARS-CoV-2 核酸檢測平臺(tái)，能夠在 1 h 內(nèi)完成對 SARS-CoV-2 的檢測。首先，在反應(yīng)管中，優(yōu)化的 DNA 探針與 SARS-CoV-2 病毒基因組保守的開放閱讀框 1ab（ORF1ab）、包膜蛋白（E）和核衣殼（N）區(qū)域結(jié)合，形成 DNA-RNA 復(fù)合物，進(jìn)而被熒光納米顆粒標(biāo)記的 S9.6 抗體捕獲；然后，在免疫熒光分析階段，將 S9.6 抗體以及抗兔IgG 抗體分別噴涂在試紙條的測試線（T）和對照線（C）上，將反應(yīng)液滴在樣品墊上，在毛細(xì)管張力的作用下，復(fù)合物到達(dá) T 區(qū)，被 S9.6 抗體捕獲，逐漸產(chǎn)生熒光信號。在 C 區(qū)，熒光納米粒子（fluorescent nanoparticles，F(xiàn)NP）標(biāo)記的兔 IgG 被抗兔 IgG 捕獲，也產(chǎn)生熒光；最后，使用熒光閱讀器讀取 T/C 熒光值來進(jìn)行定量分析。相比當(dāng)前常用的 qPCR 技術(shù)，這種新型技術(shù)的檢測限能達(dá)到每毫升 500 拷貝，且已被開發(fā)成用于診斷 SARS-CoV-2 的檢測試劑盒。