A. miRNA測定方法

MicroRNA（miRNA）為長度為18-23個堿基的單鏈核苷酸，參與細胞增殖、分化和死亡等生物過程，與許多疾病相關并可能成為疾病的生物標志物，為現代生物學與生物醫學熱門研究領域[9-10]。

人類miRNA已發現有近5千種，以其中的miRNA21為例，在Google學術限定搜索“miR 21”，結果顯示有428000篇文獻報道（圖1）。相信以“miR21"“miRNA 21”或“miRNA21"名字發表的文章應該不少，可見miRNA的研究之熱度。

 現已開發了多種檢測 miRNA 的技術，包括用放射性標記的探針進行 RNA 印跡分析[11]，基于微陣列[12]和基于聚合酶鏈式反應(PCR)的方法[13]，液相單細胞測定[14]，原位雜交[15-16]和高通量測序[17]等。然而，這些方法都有其固有的局限性，但是檢測 miRNA 依然面臨著重大挑戰。

Northern印跡法曾經是檢測miRNA的，廣泛使用標準方法，可以檢測miRNA的相對分子大小和豐度，但其也存在低通量、耗時長、易降解等缺點，并且敏感度較低，無法檢測到分子量較低的miRNA。

實時定量PCR(quantitativereal-timePCR，qRT- PCR)具有動態范圍大、靈敏度高、序列特異性強等優點，已成為檢測miRNA表達的常規和可靠技術。 但qRT-PCR測定的miRNA并非樣品的實際表達量，難于區分miRNA之間的單核苷酸差異，并且還有假陽性以及引物設計困難的問題。

微陣列技術是一種快速、高通量檢測miRNAs的方法，但成本高，不能檢測分子量較低的miRNA，對序列相似的miRNA的分辨性不好，也有假陽性問題。

一些學者開發了各種等溫分析技術，包括滾環擴增（RCA），指數擴增反應（EXPAR），環介導的等溫擴增（LAMP），雜交鏈反應和催化發夾組裝。盡管這些測定具有簡單甚至無需儀器操作的優點，但也存在限制其廣泛應用的缺點，例如EXPAR和LAMP的非特異性擴增和高背景信號，以及雜交鏈反應和催化發夾組裝的相對較慢的動力學和低靈敏度。

B. miRNA快速檢測優勢

Viagene（微奧基因）公司開發的快速microRNA Electrophoretic Fluorescence Assay (miREFA) 是檢測miRNA的有力工具，其工作原理是基于分子雜交，未雜交的探針比與RNA/DNA與探針的雜交體的分子量小，導致在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠中移動速度變化，游離探針與雜交體位置不同，探針在電泳膠中的位置通過熒光標記物在熒光掃描儀或成像儀顯現。 MiREFA具有以下優勢與特點。

1）快速出結果：miREFA技術能夠使分子雜交在20分鐘內完成，全部測定可以在2小時內完成（圖2，時間安排）。

2）靈敏度高：miREFA kits使用近紅外標記探針，并采用特殊方法大大提高檢測靈敏度，能夠測定飛克摩水平的miRNA（圖

3）檢測靈敏度）。 3.操作簡便：miREFA在現有miRNA檢測方法中為最簡便的操作技術，簡單操作與快速出結果能大大降低樣品降解（見操作說明書）。

4）分辨率高：miREFA技術能夠區分同種miRNA間的單個堿基變異（圖4），也能區分miRNA前體與成熟miRNA。

5）絕對量檢測：miREFA不涉及任何擴增，所測定的是單位樣品體積中的miRNA絕對量。

6）定量檢測：miREFA能夠對所測定的miRNA進行定量分析。

C. miREFA所需要的條件：

1）近紅外熒光標記探針（Viagene的成套試劑已包括，或選用探針定制服務）。

2）近紅外熒光探針與樣品反應結合液（Viagene的成套試劑已包括）。

3）樣品上樣液（Viagene的成套試劑已包括）。

4）用于EMSA的預制凝膠板（Viagene產品，選購項）。

5）Li Cor公司近紅外熒光掃描儀或任何能夠對700nm熒光進行掃描或成像的儀器（客戶自備）。

Viagene提供的快速miRNA檢測技術涉及多項美國專利與技術秘密。由于時間有限，現僅提供有限類別的miRNA測定Kits，如Let-7、miRNA21、MiRNA122、MiRNA144，MiRNA145、MiRNA155的檢測。為使客戶能夠開展其它類別的mRNA檢測，現開展為期兩個月的優惠活動；凡是我司尚未開發的miRNA檢測Kit，客戶只需要在成套試劑價格基礎上增加600元，我們就可以為客戶開發一套針對特定miRNA的測定kit。

Viagene的miRNA測定Kits按標簽顯示溫度存放，可以保存一年。