miRNA快速檢測


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A. miRNA測定方法

MicroRNA(miRNA)為長度為18-23個堿基的單鏈核苷酸,參與細胞增殖、分化和死亡等生物過程,與許多疾病相關并可能成為疾病的生物標志物,為現代生物學與生物醫學熱門研究領域[9-10]。

miR21_428000人類miRNA已發現有近5千種,以其中的miRNA21為例,在Google學術限定搜索“miR 21”,結果顯示有428000篇文獻報道(圖1)。相信以“miR21"“miRNA 21”或“miRNA21"名字發表的文章應該不少,可見miRNA的研究之熱度。

 現已開發了多種檢測 miRNA 的技術,包括用放射性標記的探針進行 RNA 印跡分析[11],基于微陣列[12]和基于聚合酶鏈式反應(PCR)的方法[13],液相單細胞測定[14],原位雜交[15-16]和高通量測序[17]等。然而,這些方法都有其固有的局限性,但是檢測 miRNA 依然面臨著重大挑戰。

Northern印跡法曾經是檢測miRNA的,廣泛使用標準方法,可以檢測miRNA的相對分子大小和豐度,但其也存在低通量、耗時長、易降解等缺點,并且敏感度較低,無法檢測到分子量較低的miRNA。

實時定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT- PCR)具有動態范圍大、靈敏度高、序列特異性強等優點,已成為檢測miRNA表達的常規和可靠技術。 但qRT-PCR測定的miRNA并非樣品的實際表達量,難于區分miRNA之間的單核苷酸差異,并且還有假陽性以及引物設計困難的問題。 miREFA_timeline

微陣列技術是一種快速、高通量檢測miRNAs的方法,但成本高,不能檢測分子量較低的miRNA,對序列相似的miRNA的分辨性不好,也有假陽性問題。

一些學者開發了各種等溫分析技術,包括滾環擴增(RCA),指數擴增反應(EXPAR),環介導的等溫擴增(LAMP),雜交鏈反應和催化發夾組裝。盡管這些測定具有簡單甚至無需儀器操作的優點,但也存在限制其廣泛應用的缺點,例如EXPAR和LAMP的非特異性擴增和高背景信號,以及雜交鏈反應和催化發夾組裝的相對較慢的動力學和低靈敏度。

B. miRNA快速檢測優勢miREFA_senstvty

Viagene(微奧基因)公司開發的快速microRNA Electrophoretic Fluorescence Assay (miREFA) 是檢測miRNA的有力工具,其工作原理是基于分子雜交,未雜交的探針比與RNA/DNA與探針的雜交體的分子量小,導致在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠中移動速度變化,游離探針與雜交體位置不同,探針在電泳膠中的位置通過熒光標記物在熒光掃描儀或成像儀顯現。 MiREFA具有以下優勢與特點。

1)快速出結果:miREFA技術能夠使分子雜交在20分鐘內完成,全部測定可以在2小時內完成(圖2,時間安排)。

2)靈敏度高:miREFA kits使用近紅外標記探針,并采用特殊方法大大提高檢測靈敏度,能夠測定飛克摩水平的miRNA(圖

3)檢測靈敏度)。 3.操作簡便:miREFA在現有miRNA檢測方法中為最簡便的操作技術,簡單操作與快速出結果能大大降低樣品降解(見操作說明書)。

miREFA_1base_diff4)分辨率高:miREFA技術能夠區分同種miRNA間的單個堿基變異(圖4),也能區分miRNA前體與成熟miRNA。

5)絕對量檢測:miREFA不涉及任何擴增,所測定的是單位樣品體積中的miRNA絕對量。

6)定量檢測:miREFA能夠對所測定的miRNA進行定量分析。

C. miREFA所需要的條件:

1)近紅外熒光標記探針(Viagene的成套試劑已包括,或選用探針定制服務)。

2)近紅外熒光探針與樣品反應結合液(Viagene的成套試劑已包括)。

3)樣品上樣液(Viagene的成套試劑已包括)。

4)用于EMSA的預制凝膠板(Viagene產品,選購項)。

5)Li Cor公司近紅外熒光掃描儀或任何能夠對700nm熒光進行掃描或成像的儀器(客戶自備)。

Viagene提供的快速miRNA檢測技術涉及多項美國專利與技術秘密。由于時間有限,現僅提供有限類別的miRNA測定Kits,如Let-7、miRNA21、MiRNA122、MiRNA144,MiRNA145、MiRNA155的檢測。為使客戶能夠開展其它類別的mRNA檢測,現開展為期兩個月的優惠活動;凡是我司尚未開發的miRNA檢測Kit,客戶只需要在成套試劑價格基礎上增加600元,我們就可以為客戶開發一套針對特定miRNA的測定kit。

Viagene的miRNA測定Kits按標簽顯示溫度存放,可以保存一年。

 

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